樊雪艳1 ，王倩1 ，马红云2 ，王春英2∗

（1.河北中石油中心医院药学部，河北廊坊065000；2.河北医科大学药学院，河北石家庄050017） 

收稿日期：2021 － 03 － 07

作者简介：樊雪艳（1992 － ） ，女（汉族） ，河北廊坊人，初级药师，硕士，E⁃mail 1969168126 ＠ qq. com；∗通信作者： 王春英（1972 － ） ，女（汉族） ，河北衡水人，教授，博士，主要从事中药质量控制和体内过程研究， Tel．0311－86265625，E⁃mail wangcy730301＠163. com。

摘要：

目的 比较冬虫夏草和蝉花中无机元素的含量差异，评价蝉花在某些方面代替冬虫夏草的可能性。方法 微波消解法处理冬虫夏草和蝉花样品，电感耦合等离子体质谱（ ICP⁃MS）法测定二者中24种无机元素的含量，利用SIMCA⁃P14. 0软件对数据进行主成分分析和正交偏最小二乘判别法分析。结果 24种元素线性关系良好，相关系数r ＞ 0. 995 5；精密度和重复性试验RSD≤6. 0％ ， 回收率83. 5％ ～ 110. 8％ ，RSD≤6. 0％。多元统计分析结果表明冬虫夏草和蝉花中五种元素（ Al、 Fe、Ca、K、Mn）存在显著性差异，并且Al、Fe、Ca、Mn在蝉花中的含量明显高于冬虫夏草。结论本方法适用于冬虫夏草和蝉花中无机元素的含量测定并且结合多元统计分析结果可说明蝉花比冬虫夏草在补血，补钙和抗衰老方面更具有优势。

关键词：冬虫夏草；蝉花；无机元素；电感耦合等离子体质谱法；主成分分析；正交偏最小二乘判别法分析

中图分类号： R 917　　　

文献标志码： A

冬虫夏草具有免疫调节，抗氧化，抗肿瘤和改善肾功能等药理作用［1 －2］。但由于其生长环境严苛，开发过度，使其资源短缺，价格昂贵，因此寻找其替代品变得日益迫切［3］。蝉花是一种寄生在蝉科昆虫若虫的虫生真菌，与冬虫夏草有许多相似的药理作用，临床应用广泛［4 －5］。有研究者利用GC⁃ MS代谢组学技术评价二者成分差异，结果不同成分在冬虫夏草和蝉花中不尽相同［6］。另外微量元素参与人体代谢调控，也是二者重要的药效物质基础之一并且重金属超标已成为制约中医药走向世界的一个重要因素［7 －8］。因此，本研究作者采用微波消解⁃电感耦合等离子体质谱法进行无机元素的含量测定并结合主成分分析和采用正交偏最小二乘判别法分析蝉花和冬虫夏草中无机元素的含量差异，这对于评价二者质量至关重要。

1　仪器与材料

7800电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent 公司），Multiwave Go微波消解仪（德国Anton Paar 公司），09A24S电热控温板（上海博通公司），BT 125 D分析天平（北京赛多利斯仪器公司）。

单元素标准溶液（ Na、Mg、Al、P、K、Ca、Cr、 Mn、Fe、Ba、V、Co、Ni、Cu、Zn、Sr、Sn、Pb、As、Se、 Mo、Cd、Sb、Hg）（质量浓度1 mg·L －1 ，国家有色金属及电子材料分析测试中心） ， Bi、Ge、In、Li、Lu、 Rh、Sc、Tb混合内标溶液（质量浓度100 mg·L －1 ， 美国Agilent公司），Ce、Co、Li、Mg、Tl、Y调谐液 （质量浓度1 μg·L －1 ，美国安捷伦公司），硝酸（优级纯，莱阳经济技术开发区精细化工厂） ，过氧化氢（优级纯，南京化学试剂有限公司） ，娃哈哈纯净水（杭州哇哈哈集团有限公司）。

10批蝉花和5批冬虫夏草分别购自各产地的药材市场，并经河北省药检所检定。

2　方法与结果

2. 1　检测条件

ICP⁃MS工作参数：射频功率1500 W，反射功率2 W，数据采集方式跳峰，校准方式内标法，等离子气流速15 L·min － 1 ，载气流速1. 1 L·min － 1 ， 雾化室温度2 ℃ ，泵速0. 3 r·min － 1。

微波消解程序：0 ～ 10 min室温升至130 ℃ ， 保持5 min。随后在10 min内由130 ℃升至180 ℃ ，保持30 min。 

2. 2　溶液的制备

混合标准溶液：分别精密量取24种待测元素的单元素标准溶液适量，混匀于100 mL量瓶中， 加质量分数2％ HNO3配制成一定质量浓度的混合标准溶液，该溶液中各元素质量浓度：P、Mg、K、 Ca、Al、Fe均为10 mg·L －1； Na、Mn、Zn均为 2 mg·L －1；V、Cr、Ni、Cu、Sr、Ba均为0. 5 mg·L －1； Co、As、Se、Mo、Cd、Sn、Sb、Hg均为2 μg·L －1。储存于4 ℃，以备使用。

混合内标溶液：精密量取混合内标溶液 0. 5 mL置50 mL量瓶中，用体积分数2％的硝酸稀释至刻度，摇匀，即得1 mg·L － 1混合内标溶液， 利用三通与样品或混合标准溶液一起注入电感耦合等离子体质谱仪。

供试品溶液：将蝉花和冬虫夏草药材分别粉碎，过筛备用。取药材粉末约0. 1 g，精密称定，置消解罐中，加入硝酸6 mL和体积分数为30％ H2 O2 1. 5 mL，置控温电热板上预消解，130 ℃加热30 min。预消解结束，取出消解罐，冷却至室温，盖紧盖子，进行微波消解。消解完成后，置控温电热板上，于130 ℃加热挥去硝酸，至溶液体积约为0. 5 mL取出，冷却至室温。将溶液转移至 100 mL量瓶中，用体积分数为2％的硝酸稀释至刻度，摇匀，继续取溶液5 mL转移至10 mL量瓶，用体积分数为2％的硝酸稀释至刻度，摇匀， 即得蝉花和冬虫夏草样品溶液，进样前经 0. 22 μm微孔滤膜过滤。试剂空白按照同样方法处理。

2. 3　线性关系、检测限和定量限

精密量取混合标准溶液0、0. 25、0. 5、1、2、3、 4 mL分别置于10 mL量瓶，用体积分数为2％的硝酸稀释至刻度，摇匀，即得到系列浓度的混合标准溶液。以质量浓度（ ρ，μg·L － 1 ）为横坐标，比率 （待测元素离子计数／内标元素离子计数）为纵坐标（ Y） ，得到各元素的回归方程、相关系数、检测限（ LOD）和定量限（ LOQ）结果见表1，相关系数 r2 ＞ 0. 995 5，表明24种无机元素在各自线性范围内线性关系良好。 

2. 4　精密度

取同一混合标准溶液，连续进样6次，测定各元素的含量，并计算RSD结果见表1，各元素 RSD％在1. 7％ ～ 4. 7％内，表明该方法精密度良好，符合分析检测要求。

2. 5　稳定性

分别取蝉花（ c1）和冬虫夏草（ d1）粉末各约 0. 1 g，精密称定，按“2. 2”项方法制备供试品溶液，室温下分别于0、2、4、8、12、24 h进样，依法测定24种元素含量，结果蝉花中各元素的RSD为 0. 3％ ～ 5. 7％ ，冬虫夏草中各元素的RSD为 2. 0％ ～ 5. 6％ （见表2，3） ，表明蝉花和冬虫夏草供试品溶液于室温24 h内稳定性良好。

2. 6　重复性

分别取同批次蝉花（ c1）和冬虫夏草（ d1）粉末约0. 1 g，按“2. 2”项方法各平行制备6份供试品溶液，依法测定各元素的含量并计算RSD，蝉花中各元素的RSD为0. 8％ ～ 5. 6％ ，冬虫夏草中各元素的RSD为1. 1％ ～ 5. 8％ （见表2，3） ，表明该方法重复性良好。 

2. 7　加样回收率

分别取蝉花（ c1 ）和冬虫夏草粉末（ d1 ）约 0. 05 g，加入适量的混合标准溶液，使加入量与所取供试品中待测元素含量之比控制在1∶ 1左右， 按“2. 2”项方法平行制备6份供试品溶液。依法测定24种元素含量，计算加样回收率及其 RSD％。结果见表2和表3，各元素平均回收率在83. 5％ ～ 110. 8％内，RSD在1. 0％ ～ 5. 4％内， 表明该方法准确度良好。

2. 9　统计分析

采用SIMCA⁃p 14. 0 （ Umetrics， Umea， Swe⁃ den）软件对测定结果进行主成分分析（ PCA） ，结果Q2为0. 442，R2为0. 715，如图1所示，蝉花和冬虫夏草样品可以区分开，说明二者在微量元素的分布上存在差异，并且根据不同批次的样品在 PCA得分图中的分布，可以发现不同批次蝉花样品之间元素含量差异比较大，而冬虫夏草样品则比较均匀。

为获得更高程度的分组和确定组间差异性元素，继而采用正交偏最小二乘判别法（ OPLS⁃DA） 分析，另外将蝉花和冬虫夏草含量测定结果导入 SPSS Statistics 21（ IBM，USA）软件进行独立样本 t检验得到P值，同时满足P ＜ 0. 05和VIP ＞ 1的元素被认为是两味药材的差异性元素，结果如图 2。结果显示两味药材可以明显地区分开，并且筛选出Al、Fe、Ca、K和Mn作为蝉花和冬虫夏草的差异性元素，其中Al、Fe、Ca和Mn在蝉花中的含量明显高于冬虫夏草，而K的含量在冬虫夏草中偏高，结果见图3。

3　讨论

3. 1　消解液的种类及用量

通常用于微波消解的消解液包括以下几种组合：浓HNO3、浓HNO3 ＋ H2 O2、王水（浓HCl：浓 HNO3体积比3∶ 1）、逆王水（浓HCl：浓HNO3体积比1 ∶ 3）、浓HNO3 ＋浓H2 SO4等。王水、逆王水中的35 Cl元素与高纯氩形成40 Ar35 Cl，产生多原子离子干扰，会对75As的测定结果产生影响［9］。 H2 SO4同样也是极强的氧化性酸，可消解塑料，矿石，地质样品等，但是其挥发性差会使赶酸过程困难并且容易与Ba、Pb、Ca形成不溶性硫酸盐导致干扰。由于HClO4与有机物结合可能发生爆炸， 因此微波消解不可选用HClO4做消解试剂，有爆炸危险［10］。因此应避免使用浓HCl、浓H2 SO4和 HClO4。H2 O2可增强硝酸的氧化性使反应速度加快，因此本试验作者以HNO3 ＋ H2 O2为消解试剂进行微波消解。只以6 mL HNO3进行消解时， 结束后可见明显黑色不溶物。以6 mL HNO3 ＋ 1 mL H2 O2 消解后样品浑浊，消解不彻底。以 6 mL HNO3 ＋ 1. 5 mL H2 O2为消解试剂，可得澄清样品，综合考虑绿色环保及对试验人员防护最终确定以此条件进行样品消解。

3. 2　蝉花和冬虫夏草中无机元素的分析

本研究作者采用ICP⁃MS法测定10批蝉花和5批冬虫夏草样品中24种无机元素的含量。 分析结果显示蝉花和冬虫夏草中宏量元素以K、 Mg、P、Ca含量较丰富，人体必需微量元素中Mn、 Fe、Zn和Se含量明显高于其它元素。K作为机体中重要的电解质可以用来控制体液渗透压和保持酸碱平衡［11］ ；Ca和Mg是骨骼和结构组织正常发育所必需的宏量元素，并且可参与神经及免疫信息传导［12］ ；Fe与人体免疫系统关系密切，同时也参与氧气运输和物质代谢过程，改善人体造血功能［13］ ；Zn含量充足才能有效保证胸腺发育， 正常分化T细胞，促进细胞免疫功能进而增强人体免疫力［14］ ；微量元素Mn也是免疫系统所必需的，因为它能激活体内许多酶的活性，参与许多酶的反应，并且Zn和Mn具有益肝、补肾功效［15 － 16］ ；Se对人体具有广泛的多效性作用，特别是在降低肝癌、前列腺癌、结肠直肠癌和肺癌的发病率和死亡率方面有着不可替代的作用［17］。以上元素所表现出的生理功效与蝉花和冬虫夏草的免疫调节、滋补强壮、补肾益肺、抗肿瘤等药理作用相一致，因此可认为蝉花和冬虫夏草中所含有的这些无机元素是它们的药效物质基础之一。

本研究作者同样对非必需微量元素Al、Ba 进行含量测定，结果蝉花和冬虫夏草中的Al元素均超过100 ppm尤其是蝉花中Al含量更高而Ba 在两种样品中含量均为10 ppm左右。尽管目前中药和食品中对Al和Ba没有明确的限量，但是他们的过度摄入和蓄积都会对人体造成损害。Al 的异常富集可能会造成对组织和器官的伤害尤其是对中枢神经系统和肾脏的损伤，例如阿尔兹海默病［18］。在正常条件下，钡元素对人体无明显的营养作用和毒害作用。然而，一些钡盐通常对人类是有毒害的。因此在考虑蝉花和冬虫夏草入药或食用时需要注意这些非必需微量元素的摄入量以减少可能的毒性作用。

　　重金属及有害元素是中药材安全性评价的重要指标。本文测定蝉花和冬虫夏草中的有害微量元素包括As、Cd、Sb、Hg和Pb，应该限制在极低的范围内。Cu是人体必需的微量元素但同时也是重金属，摄入过量同样存在危害。为保障用药安全，包括Cu在内的重金属元素（ Cu、As、Pb、 Cd、Hg）都需要检测以免超出限度。《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》中规定铅（ Pb） ≤ 5. 0 mg·kg －1 ，镉（ Cd） ≤0. 3 mg·kg －1 ，汞（ Hg） ≤ 0. 2 mg·kg －1 ，铜（Cu） ≤20. 0 mg·kg －1 ，砷（As） ≤ 2. 0 mg·kg －1。由表3可以发现，Sb含量在两种虫草样品中都是极低的，10批蝉花中有5批出现 Cd元素超标尤其是安徽省样品，其余重金属并未发现超标；5批冬虫夏草均发现As超标，其余重金属均在规定限度内。因此对蝉花和冬虫夏草进行质量检查时应重点关注重金属元素Cd和As， 以确保蝉花和冬虫夏草临床用药的安全有效。

为全面地了解两味药材中微量元素的分布情况及主要差异性成分，本研究采用SIMCA⁃P软件中的PCA和OPLS⁃DA模型对蝉花和冬虫夏草含量测定结果进行比较分析。结果显示，蝉花和冬虫夏草样品的差异性元素为Al、Fe、Ca、K和Mn。 含量测定结果显示蝉花中Fe和Ca的含量是冬虫夏草的3 ～ 5倍，而Mn的含量是冬虫夏草的近10 倍。微量元素Mn除了可以提高机体免疫功能外还是超氧化物歧化酶（ SOD）的主要成分之一， SOD可用于消除自由基，对机体产生保护作用， 从而减缓衰老，使人长寿［19］。因此，根据二者无机元素的含量测定及比较分析结果可以发现蝉花和冬虫夏草都富含人体必需微量元素，尤其是蝉花在补血、补钙及抗衰老延缓寿命方面更有明显优势。

4　结论 i（a9n）g：Y1 u－a4ns． u Kexue （广东微量元素科学），2002，9

本研究作者首次采用了微波消解ICP⁃MS法同时测定了10批蝉花和5批冬虫夏草样品中24种无机元素的含量。同时采用多元统计分析的方法区分蝉花和冬虫夏草并找出了两者间的差异性元素（ Al、Fe、Ca、K和Mn）。24种无机元素，尤其是重金属元素的含量测定结果为蝉花和冬虫夏草的药效物质基础和质量控制提供了重要依据。 此外，这两者间的差异表明蝉花中Fe、Ca以及 Mn的含量显著高于冬虫夏草，因此蝉花在补血， 补钙和抗衰老方面具有更大的优势。

参考文献：

［ 1 ］ CHEUNG K H，LI J，CHEUNG W H，et al． Cordysi⁃nocan， a polysaccharide isolated from cultured Cordyceps，activates immune responses in cultured T⁃lymphocytes and macrophages：Signaling cascade and induction of cytokines ［ J］．J Ethnopharmacol，2009， 124（1） ：61 － 68．

［ 2 ］ ZHANG H W，LIN Z X，TUNG Y S，et al． Cordyceps sinensis （ a traditional Chinese medicine） for treating chronic kidney disease ［ J ］ ． Cochrane Database Syst Rev，2014，12，CD008353．

［ 3 ］ CHENG L Y， QIU Y， PENG C， et al． Study on the management rules of ophiocordyceps sinensis re⁃ sources［ J］ ． Lishizhen Medicine and Materia Medica Research（时珍国医国药） ，2015，26（2） ：449 － 450．

［ 4 ］ ZENG W B，YU H，GE F，et al． Distribution of nucle⁃osides in populations of Cordyceps cicadae［ J］ ． Mole⁃ cules，2014，19：6123 － 6141．

［ 5 ］ LIU T F， ZHANG H M， SHI X S， et al． Illumina MiSeq sequencing investigation of Chanhua（ Cordyceps cicadae Shing） fungal community struc⁃tures in different regions ［ J ］ ． Journal of Traditional Chinese Medical Sciences （中医药杂志） ， 2018， 5 （2） ：206 － 212．

［ 6 ］ ZHANG J S，YU H，ZHONG X，et al． Comparison of quality of Ophiocordyceps sinensis and Isaria cicadae based on GC⁃MS metabonomics［ J］ ． Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae （中国实验方剂学） ，2018，24（18） ：23 － 29．

［ 7 ］ YAN S M，LI Z X，XIONG L P． Essentials of trace el⁃ement medicine Ⅰ physiological role and balance of trace elements in human body［ J］ ． Guangdong Weil⁃

［ 8 ］ HE C． Analysis on excessive heavy metal problem of Chinese materia medica exports to EU from perspec⁃ tive of UK ban ［ J］ ． Chinese Traditional and Herbal Drugs（中草药） ，2016，47（10） ：1820 － 1824．

［ 9 ］ SHEN Y，ZAHNG N，GAO X H，et al． Simultaneous determination of V，Cr，Ni，Ge and As in geochemical samples by ICP⁃MS combined with microwave diges⁃ tion sample preparation［ J］ ． Rock and Mineral Analy⁃ sis（岩矿测试） ，2014，33（5） ：649 － 654．

［10］ LIU D L，LIU H Y，LIU Z Y． The Application of mi⁃crowave⁃assisted digestion technology in environmen⁃ tal analysis［ J］ ． Journal of Tangshan Teachers Collge （唐山师范学院学报） ，2006，28（5） ：42 － 44．

［11］ ZHAO X S，WEI J H，SHU X Y，et al． Multi⁃elements determination in medical and edible Alpinia Oxyphylla and Morinda Officinalis and their decoctions by ICP⁃ MS［ J］ ． Chemosphere，2016，164：430 － 435．

［12］ DESIDERI D， MELI M A， ROSELLI C． Determina⁃tion of essential and non⁃essential elements in some medicinal plants by polarised X ray fluorescence spec⁃ trometer（ EDPXRF） ［ J］ ． Microchemical J，2010，95 （2） ：174 － 180．

［13］ YE C X，LIU Y J，MAI K S，et al． Effect of dietary i⁃ron supplement on growth，haematology and microele⁃ ments of juvenile grouper，Epinephelus Coioides［ J］．Aquac Nutri，2010，13（6） ：471 － 477．

［14］ XIAOX L，WANG X Q，HUANG X L，et al． Analysis of trace elements in Ganoderma lucidum spore oil ［ J］ ． Modern Food Science and Technology （现代食品科技） ，2017，33（8） ：282 － 288．

［15］ SMITH E A，NEWLAND P，BESTWICK K G，et al．Increased whole blood manganese concentrations ob⁃ served in children with iron deficiency anaemia［ J］ ． J Trace Elem Med Biol，2013，27（1） ：65 － 69．

［16］ CONG T，ZHAO L． Detection of trace elements Zn，Cu，Fe，Se and Mn and their clinical nutritional signifi⁃ cance［ J］ ． Studies of Trace Elements and Health（微量元素与健康研究） ，2006，23（6） ：59 － 61．

［17］ RAYMAN M P． Selenium in cancer prevention：a re⁃view of the evidence and mechanism of action［J］． Proc Nutri Soc，2005，64（4）：16．

［18］ YUAN Y，YANG J． Content determination of alumin⁃ium in 3 kinds of Chinese patent medicine for sale ［ J］ ． China Pharmacy （中国药房） ， 2010， 21 （ 27 ） ：

2557 － 2559．

［19 ］ PARSONS P J， BARBOSA F． Atomic spectrometry and trends in clinical laboratory medicine［ J］ ． Spectro⁃ chim Acta B，2007，62（9） ：992 － 1003．

Difference analysis of inorganic elements in Cordyceps sinensis and Cordyceps cicadae by ICP⁃MS with microwave digestion method

FAN Xueyan1 ，WANG Qian1 ，MA Hongyun2 ，WANG Chunying2∗

（1. Department of Pharmacy， Hebei Petrochina Central Hospital， Langfang 065000， China； 2. School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

Abstract： Objective To compare the differences of inorganic elements in Cordyceps sinensis （ C．sinensis） and Cordyceps cicadae （ C．cicadae） ， and evaluate the possibility of C． cicadae replacing C． sinensis in certain asprcts． Methods The contents of 24 inorganic elements C． sinensis and in C． cicadae sample were analyzed by microwave digestion coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry （ ICP⁃MS） method． The principal component analysis（ PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （ OPLS⁃DA ） were analyzed for with SIMCA⁃P14. 0 software． Results The 24 elements showed good linearities in the selected concentration ranges（ r2 ＞ 0. 9911） ． The relative standard deviations （ RSDs） of the precision and repeatability were less than 6. 0％ ． The average recovery ranged from 73. 76％ to 105. 6％ ， with RSD ≤ 6. 0％ ． The results of multivariate statistical analysis showed that there were significant differences in the five elements （ Al，Fe，Ca，K，Mn） between C. sinensis and C. cicadae and the content of Al，Fe，Ca and Mn in C. cicadae was significantly higher than that in C. sinensis． Conclusion The established method is simple and fast with high sensitivity and good accuracy，and is suitable for the determination of inorganic elements in C. sinensis and C. cicadae samples． Combined with the results of multivariate statistical analysis，it can be concluded that C. cicadae has more advantages than C. sinensis in terms of blood supplementation，calcium supplementation and anti⁃aging．

Key words： Cordyceps sinensis； Cordyceps cicadae； inorganic elements； microwave digestion； ICP⁃MS；PCA；OPLS⁃DA