Thuan Duc Lao#, Hanh Van Trinh#, Loi Vuong, Luyen Tien Vu, Thuy Ai Huyen Le,
Hiep Minh Dinh, Nguyen Binh Truong*
DOI: 10.1515/biol-2021-0074
接收日期: 2020年2月18日；
接受日期: 2021年6月19日
摘要: 从越南达乐省咖啡园中采集的寄生在蝉若虫上的昆虫病原真菌T011，初步通过形态学鉴定为蝉花（Isaria cicadae），属于肉座菌目（Hypocreales）和麦角菌科（Clavicipitaceae）。为了确保T011的真实性，应用了包括ITS、nrLSU、nrSSU、Rpb1和Tef1在内的多基因串联系统发育分析来支持鉴定。从干燥的T011样品中提取了基因组DNA，并通过PCR测序扩增了ITS、nrLSU、nrSSU、Rpb1和Tef1基因。系统发育分析使用MEGAX软件构建了基于邻接法、最大似然法和最大简约法的1000次重复的自举分析。结果显示，串联数据集包含62个属于肉座菌目、麦角菌科的序列，以及2个属于肉座菌目、轮枝孢属（Verticillium）的外群序列。系统发育分析结果表明，T011被归类于虫草（Cordyceps）亚支，并与参考的蝉花（Cordyceps cicadae，Isaria cicadae的有性型）形成了高度支持的单系群。系统发育分析结果与形态学分析结果一致，进一步支持了T011为蝉花的鉴定。综上所述，基于多基因串联数据集的系统发育分析成功强化了T011为蝉花的鉴定。
关键词: 核小亚基核糖体RNA，核大亚基核糖体RNA，蝉花，系统发育
1 引言
蝉花（Isaria cicadae Miq., Bull. Sci. phys. nat. néerl.: 86 (1838)），也称为蝉草（Cordyceps cicadae (Miq.) Massee (1895)），是一种能够寄生在蝉若虫上的昆虫病原真菌，属于肉座菌目和麦角菌科。蝉草通常分布在温度范围为18至24°C、相对湿度大于80%的地区，生长在海拔700至950米的向阳坡地上。蝉草的分布记录包括中国（云南、四川、贵州、江苏、广东、湖南、湖北等省份）、韩国（济州岛）和日本（福岛南部）。此外，泰国、北美和欧洲也有分布。
由于其多种生物活性，蝉花和蝉草被视为最具价值的中药材之一。其药用活性成分，如腺苷、虫草素、麦角固醇等，已被用于缓解疲劳、治疗多种疾病（如抗肿瘤活性）以及作为食物来源。为了获取这种珍贵的中药材，探索和收集当地的蝉花（蝉草）对于进一步药用应用具有重要意义。在达乐省Ea Knop镇Ea Kar区的真菌多样性考察中，我们采集了寄生在蝉若虫上的T011样本，并通过形态学和分子系统发育分析确认其为蝉花。
2 材料与方法
2.1 样本采集
T011样本于2018年6月24日上午在达乐省Ea Kar区Ea Knop镇的咖啡园中采集。样本在实验室中60°C干燥并保存以供进一步分析。
2.2 形态学分析
对新鲜样本的宏观特征进行了详细观察。微观分析中，将分生孢子梗切成小块，浸泡在水中3分钟，然后在显微镜下观察。分生孢子的大小被记录，并根据分生孢子和菌落的颜色进行鉴定。
2.3 DNA提取、PCR扩增及目标基因测序
使用酚/氯仿法从干燥材料中提取基因组DNA。通过PCR扩增ITS、nrLSU、nrSSU、Rpb1和Tef1基因，并在2.0%琼脂糖凝胶上电泳。扩增产物由越南Nam Khoa公司进行测序。
2.4 系统发育分析
从GenBank下载了ITS、nrLSU、nrSSU、Rpb1和Tef1序列，并使用MEGA X软件构建了基于邻接法、最大似然法和最大简约法的系统发育树。
3 结果
3.1 形态学分析
T011样本的形态特征与蝉花一致，包括菌丝体白色、分生孢子圆柱形等。
3.2 ITS、nrLSU、nrSSU、Rpb1和Tef1基因的扩增
通过PCR扩增获得了ITS、nrLSU、nrSSU、Rpb1和Tef1基因的清晰条带，测序结果显示与蝉草（Cordyceps cicadae）高度相似。
3.3 系统发育分析
系统发育分析显示，T011与蝉草（Cordyceps cicadae）形成了高度支持的单系群，进一步确认了T011为蝉花的鉴定。
4 讨论
形态学和分子系统发育分析均支持T011为蝉花的鉴定。这是越南首次通过分子手段记录蝉花的存在。
5 结论
通过多基因系统发育分析，我们成功鉴定了从达乐省Ea Knop镇Ea Kar区采集的T011样本为蝉花（Isaria cicadae），这是越南首次对该物种的分子记录。
致谢: 感谢越南国家科学与技术发展基金会（NAFOSTED）和胡志明市开放大学对本研究的支持。
资助信息: 本研究由越南国家科学与技术发展基金会（NAFOSTED）和胡志明市开放大学资助。